ປັດໄຈແຊກແຊງໃນປະຕິກິລິຍາ PCR

ໃນລະຫວ່າງປະຕິກິລິຍາ PCR, ມັກຈະພົບປັດໄຈແຊກແຊງບາງຢ່າງ.
ເນື່ອງຈາກ PCR ມີຄວາມອ່ອນໄຫວສູງຫຼາຍ, ການປົນເປື້ອນຈຶ່ງຖືກຖືວ່າເປັນໜຶ່ງໃນປັດໃຈທີ່ສຳຄັນທີ່ສຸດທີ່ສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ຜົນການກວດ PCR ແລະສາມາດສ້າງຜົນໄດ້ຮັບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.
ແຫຼ່ງຕ່າງໆທີ່ນຳໄປສູ່ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງກໍ່ມີຄວາມສຳຄັນເທົ່າທຽມກັນ. ຖ້າສ່ວນທີ່ສຳຄັນໜຶ່ງ ຫຼື ຫຼາຍສ່ວນຂອງສ່ວນປະສົມ PCR ຫຼື ປະຕິກິລິຍາຂະຫຍາຍຕົວຖືກຍັບຍັ້ງ ຫຼື ແຊກແຊງ, ການວິເຄາະການວິນິດໄສອາດຈະຖືກຂັດຂວາງ. ສິ່ງນີ້ສາມາດນຳໄປສູ່ປະສິດທິພາບຫຼຸດລົງ ແລະ ແມ່ນແຕ່ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.
ນອກເໜືອໄປຈາກການຍັບຍັ້ງ, ການສູນເສຍຄວາມສົມບູນຂອງກົດນິວເຄຼຍອິກເປົ້າໝາຍອາດຈະເກີດຂຶ້ນຍ້ອນເງື່ອນໄຂການຂົນສົ່ງ ແລະ/ຫຼື ການເກັບຮັກສາກ່ອນການກະກຽມຕົວຢ່າງ. ໂດຍສະເພາະ, ອຸນຫະພູມສູງ ຫຼື ການເກັບຮັກສາທີ່ບໍ່ພຽງພໍອາດຈະນໍາໄປສູ່ຄວາມເສຍຫາຍຂອງຈຸລັງ ແລະ ກົດນິວເຄຼຍອິກ. ການຕິດຈຸລັງ ແລະ ເນື້ອເຍື່ອ ແລະ ການຝັງພາຣາຟິນແມ່ນສາເຫດທີ່ຮູ້ຈັກກັນດີຂອງການແຕກແຍກຂອງ DNA ແລະ ເປັນບັນຫາທີ່ຍັງຄົງຄ້າງ (ເບິ່ງຮູບທີ 1 ແລະ 2). ໃນກໍລະນີເຫຼົ່ານີ້, ເຖິງແມ່ນວ່າການແຍກ ແລະ ການເຮັດໃຫ້ບໍລິສຸດທີ່ດີທີ່ສຸດກໍ່ຈະບໍ່ຊ່ວຍໄດ້.

ຮູບທີ 1 | ຜົນກະທົບຂອງການຢຸດການເຄື່ອນໄຫວຕໍ່ຄວາມສົມບູນຂອງ DNA
ການວິເຄາະດ້ວຍເຈວ Agarose electrophoresis ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຄຸນນະພາບຂອງ DNA ທີ່ແຍກອອກມາຈາກພາກສ່ວນ paraffin ຂອງການຊันນະສູດແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. DNA ທີ່ມີຄວາມຍາວຂອງຊິ້ນສ່ວນສະເລ່ຍແຕກຕ່າງກັນມີຢູ່ໃນສານສະກັດໂດຍອີງຕາມວິທີການແກ້ໄຂ. DNA ຈະຖືກຮັກສາໄວ້ພຽງແຕ່ເມື່ອແກ້ໄຂໃນຕົວຢ່າງແຊ່ແຂງພື້ນເມືອງ ແລະ ໃນ formalin ທີ່ເປັນກາງທີ່ມີ buffered. ການໃຊ້ສານແກ້ໄຂ Bouin ທີ່ມີກົດຮຸນແຮງ ຫຼື formalin ທີ່ບໍ່ມີ buffered, ທີ່ມີກົດ formic ເຮັດໃຫ້ DNA ສູນເສຍຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ສ່ວນທີ່ເຫຼືອແມ່ນມີການແຕກແຍກສູງ.
ຢູ່ເບື້ອງຊ້າຍ, ຄວາມຍາວຂອງຊິ້ນສ່ວນຕ່າງໆແມ່ນສະແດງເປັນຄູ່ກິໂລເບສ (kbp)

ຮູບທີ 2 | ການສູນເສຍຄວາມສົມບູນຂອງເປົ້າໝາຍກົດນິວເຄຼຍອິກ
(ກ) ຊ່ອງຫວ່າງ 3′-5′ ຢູ່ທັງສອງສາຍຈະເຮັດໃຫ້ DNA ເປົ້າໝາຍແຕກ. ການສັງເຄາະ DNA ຍັງຈະເກີດຂຶ້ນຢູ່ໃນຊິ້ນສ່ວນຂະໜາດນ້ອຍ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຖ້າບໍ່ມີບ່ອນອົບແຫ້ງແບບ primer ຢູ່ໃນຊິ້ນສ່ວນ DNA, ຈະມີພຽງແຕ່ການຂະຫຍາຍເສັ້ນຊື່ເທົ່ານັ້ນທີ່ຈະເກີດຂຶ້ນ. ໃນກໍລະນີທີ່ເອື້ອອຳນວຍທີ່ສຸດ, ຊິ້ນສ່ວນອາດຈະອີ່ມຕົວກັນຄືນ, ແຕ່ຜົນຜະລິດຈະນ້ອຍ ແລະ ຕໍ່າກວ່າລະດັບການກວດຈັບ.
(ຂ) ການສູນເສຍເບສ, ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຍ້ອນການເສື່ອມສະພາບ ແລະ ການສ້າງທາດໄທມີດີນໄດເມີ, ນຳໄປສູ່ການຫຼຸດລົງຂອງຈຳນວນພັນທະ H ແລະ ການຫຼຸດລົງຂອງ Tm. ໃນລະຫວ່າງໄລຍະການອຸ່ນຂຶ້ນທີ່ຍາວນານ, ໄພຣເມີຈະລະລາຍອອກຈາກ DNA ຂອງແມັດຕຣິກ ແລະ ຈະບໍ່ລະລາຍເຖິງແມ່ນວ່າຈະຢູ່ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ເຂັ້ມງວດໜ້ອຍກວ່າ.
(ຄ) ເບສໄທມີນທີ່ຢູ່ຕິດກັນປະກອບເປັນໄດເມີ TT.
ບັນຫາທົ່ວໄປອີກອັນໜຶ່ງທີ່ມັກເກີດຂຶ້ນໃນການວິນິດໄສໂມເລກຸນແມ່ນການປ່ອຍກົດນິວເຄຼຍອິກເປົ້າໝາຍທີ່ບໍ່ດີທີ່ສຸດເມື່ອທຽບກັບການສະກັດເອົາຟີນອນ-ຄລໍໂຣຟອມ. ໃນກໍລະນີທີ່ຮ້າຍແຮງ, ສິ່ງນີ້ສາມາດກ່ຽວຂ້ອງກັບຜົນລົບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ. ເວລາຫຼາຍສາມາດປະຫຍັດໄດ້ໂດຍການຕົ້ມການລະລາຍ ຫຼື ການຍ່ອຍສະຫຼາຍຂອງຊາກຈຸລັງດ້ວຍເອນໄຊມ໌, ແຕ່ວິທີການນີ້ມັກຈະເຮັດໃຫ້ຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ PCR ຕ່ຳເນື່ອງຈາກການປ່ອຍກົດນິວເຄຼຍອິກບໍ່ພຽງພໍ.

ການຍັບຍັ້ງກິດຈະກຳຂອງໂພລີເມີເຣສໃນລະຫວ່າງການຂະຫຍາຍ

ໂດຍທົ່ວໄປ, ການຍັບຍັ້ງຖືກນໍາໃຊ້ເປັນແນວຄວາມຄິດບັນຈຸເພື່ອອະທິບາຍປັດໃຈທັງໝົດທີ່ນໍາໄປສູ່ຜົນໄດ້ຮັບ PCR ທີ່ບໍ່ດີ. ໃນຄວາມໝາຍທາງຊີວະເຄມີຢ່າງເຂັ້ມງວດ, ການຍັບຍັ້ງແມ່ນຈໍາກັດຕໍ່ກິດຈະກໍາຂອງເອນໄຊມ໌, ເຊັ່ນ: ມັນຫຼຸດຜ່ອນຫຼືປ້ອງກັນການປ່ຽນແປງຂອງ substrate-product ຜ່ານການພົວພັນກັບ active site ຂອງ DNA polymerase ຫຼື cofactor ຂອງມັນ (ເຊັ່ນ, Mg2+ ສໍາລັບ Taq DNA polymerase).
ສ່ວນປະກອບໃນຕົວຢ່າງ ຫຼື ບັຟເຟີ ແລະ ສານສະກັດຕ່າງໆທີ່ມີສານປະຕິກິລິຍາສາມາດຍັບຍັ້ງເອນໄຊໂດຍກົງ ຫຼື ດັກຈັບໂຄຟາກເຕີຂອງມັນ (ເຊັ່ນ EDTA), ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງເຮັດໃຫ້ໂພລີເມີເຣສບໍ່ເຮັດວຽກ ແລະ ນຳໄປສູ່ຜົນ PCR ທີ່ຫຼຸດລົງ ຫຼື ມີຜົນລົບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.
ເຖິງຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ການພົວພັນຫຼາຍຢ່າງລະຫວ່າງອົງປະກອບປະຕິກິລິຍາ ແລະ ກົດນິວເຄຼຍອິກທີ່ມີເປົ້າໝາຍກໍ່ຖືກກຳນົດວ່າເປັນ 'ຕົວຍັບຍັ້ງ PCR'. ເມື່ອຄວາມສົມບູນຂອງຈຸລັງຖືກລົບກວນໂດຍການແຍກຕົວ ແລະ ກົດນິວເຄຼຍອິກຖືກປ່ອຍອອກມາ, ການພົວພັນລະຫວ່າງຕົວຢ່າງ ແລະ ສານລະລາຍອ້ອມຂ້າງ ແລະ ໄລຍະແຂງສາມາດເກີດຂຶ້ນໄດ້. ຕົວຢ່າງ, 'ຕົວກຳຈັດສິ່ງເສດເຫຼືອ' ສາມາດຜູກມັດ DNA ສາຍດຽວ ຫຼື ສາຍຄູ່ຜ່ານການພົວພັນທີ່ບໍ່ແມ່ນໂຄວາເລນ ແລະ ແຊກແຊງການແຍກຕົວ ແລະ ການບໍລິສຸດໂດຍການຫຼຸດຜ່ອນຈຳນວນເປົ້າໝາຍທີ່ໃນທີ່ສຸດໄປຮອດພາຊະນະປະຕິກິລິຍາ PCR.
ໂດຍທົ່ວໄປ, ຕົວຍັບຍັ້ງ PCR ມີຢູ່ໃນນໍ້າໃນຮ່າງກາຍສ່ວນໃຫຍ່ ແລະ ສານປະຕິກິລິຍາທີ່ໃຊ້ສຳລັບການກວດວິນິດໄສທາງຄລີນິກ (ຢູເຣຍໃນນໍ້າປັດສະວະ, ຮີໂມໂກລບິນ ແລະ ເຮປາຣິນໃນເລືອດ), ອາຫານເສີມ (ສ່ວນປະກອບອິນຊີ, ໄກໂຄເຈນ, ໄຂມັນ, ໄອອອນ Ca2+) ແລະ ສ່ວນປະກອບໃນສິ່ງແວດລ້ອມ (ຟີນອນ, ໂລຫະໜັກ)

ຕົວຍັບຍັ້ງ PCR ທີ່ມີຫຼາຍກວ່າສາມາດພົບໄດ້ໃນເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ ແລະ ຈຸລັງ eukaryotic, DNA ທີ່ບໍ່ແມ່ນເປົ້າໝາຍ, macromolecules ທີ່ຜູກມັດ DNA ຂອງ matrices ເນື້ອເຍື່ອ ແລະ ອຸປະກອນຫ້ອງທົດລອງເຊັ່ນ: ຖົງມື ແລະ ພາດສະຕິກ. ການເຮັດໃຫ້ກົດນິວເຄຼຍອິກບໍລິສຸດໃນລະຫວ່າງ ຫຼື ຫຼັງການສະກັດເອົາແມ່ນວິທີການທີ່ນິຍົມໃຊ້ສຳລັບການກຳຈັດຕົວຍັບຍັ້ງ PCR.
ໃນປະຈຸບັນ, ອຸປະກອນສະກັດເອົາອັດຕະໂນມັດຕ່າງໆສາມາດທົດແທນໂປໂຕຄອນຄູ່ມືຫຼາຍຢ່າງ, ແຕ່ການກູ້ຄືນ ແລະ/ຫຼື ການເຮັດໃຫ້ບໍລິສຸດເປົ້າໝາຍ 100% ບໍ່ເຄີຍບັນລຸໄດ້. ຕົວຍັບຍັ້ງທີ່ມີທ່າແຮງອາດຈະຍັງມີຢູ່ໃນກົດນິວເຄຼຍອິກທີ່ຖືກບໍລິສຸດ ຫຼື ອາດຈະມີຜົນແລ້ວ. ມີຍຸດທະສາດທີ່ແຕກຕ່າງກັນເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຜົນກະທົບຂອງຕົວຍັບຍັ້ງ. ການເລືອກໂພລີເມີເຣສທີ່ເໝາະສົມສາມາດມີຜົນກະທົບຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຕໍ່ກິດຈະກຳຂອງຕົວຍັບຍັ້ງ. ວິທີການອື່ນໆທີ່ພິສູດແລ້ວເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການຍັບຍັ້ງ PCR ແມ່ນການເພີ່ມຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂພລີເມີເຣສ ຫຼື ການໃຊ້ສານເຕີມແຕ່ງເຊັ່ນ BSA.
ການຍັບຍັ້ງປະຕິກິລິຍາ PCR ສາມາດສະແດງໃຫ້ເຫັນໄດ້ໂດຍການນໍາໃຊ້ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບຂະບວນການພາຍໃນ (IPC).
ຕ້ອງລະມັດລະວັງໃນການກຳຈັດສານປະຕິກິລິຍາ ແລະ ສານລະລາຍອື່ນໆທັງໝົດໃນຊຸດສະກັດ, ເຊັ່ນ: ເອທານອນ, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol ແລະ phenol, ອອກຈາກສານແຍກກົດນິວຄລີອິກໂດຍຂັ້ນຕອນການລ້າງຢ່າງລະອຽດ. ພວກມັນອາດຈະກະຕຸ້ນ ຫຼື ຍັບຍັ້ງ PCR ຂຶ້ນກັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງພວກມັນ.