ການແກ້ໄຂບັນຫາ PCR Analyzer: ຄໍາຖາມທີ່ຖາມເລື້ອຍໆແລະວິທີແກ້ໄຂ

ການວິເຄາະລະບົບຕ່ອງໂສ້ Polymerase (PCR) ແມ່ນເຄື່ອງມືທີ່ຈໍາເປັນໃນຊີວະວິທະຍາໂມເລກຸນ, ໃຫ້ນັກຄົ້ນຄວ້າຂະຫຍາຍ DNA ສໍາລັບຄໍາຮ້ອງສະຫມັກຕ່າງໆຕັ້ງແຕ່ການຄົ້ນຄວ້າພັນທຸກໍາຈົນເຖິງການວິນິດໄສທາງດ້ານຄລີນິກ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບອຸປະກອນທີ່ສັບສົນ, ເຄື່ອງວິເຄາະ PCR ສາມາດພົບບັນຫາທີ່ມີຜົນກະທົບຕໍ່ການປະຕິບັດຂອງມັນ. ບົດຄວາມນີ້ໄດ້ກ່າວເຖິງບາງຄໍາຖາມທົ່ວໄປກ່ຽວກັບເຄື່ອງວິເຄາະ PCRການ​ແກ້​ໄຂ​ບັນ​ຫາ​ແລະ​ສະ​ຫນອງ​ການ​ແກ້​ໄຂ​ປະ​ຕິ​ບັດ​ສໍາ​ລັບ​ບັນ​ຫາ​ທົ່ວ​ໄປ​.

1. ເປັນຫຍັງປະຕິກິລິຍາ PCR ຂອງຂ້ອຍບໍ່ຂະຫຍາຍອອກ?

ຫນຶ່ງໃນບັນຫາທົ່ວໄປທີ່ສຸດທີ່ຜູ້ໃຊ້ປະເຊີນຫນ້າແມ່ນຄວາມບໍ່ສາມາດຂອງປະຕິກິລິຍາ PCR ເພື່ອຂະຫຍາຍ DNA ເປົ້າຫມາຍ. ນີ້ສາມາດເປັນປັດໃຈຈໍານວນຫນຶ່ງ:

ການອອກແບບ primer ບໍ່ຖືກຕ້ອງ: ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າ primers ຂອງທ່ານແມ່ນສະເພາະສໍາລັບລໍາດັບເປົ້າຫມາຍແລະມີອຸນຫະພູມການລະລາຍທີ່ເຫມາະສົມ (Tm). ໃຊ້ເຄື່ອງມືຊອບແວສໍາລັບການອອກແບບ primer ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການຜູກມັດທີ່ບໍ່ສະເພາະ.

DNA ແມ່ແບບບໍ່ພຽງພໍ: ກວດສອບວ່າທ່ານກໍາລັງໃຊ້ DNA ແມ່ແບບຈໍານວນພຽງພໍ. ໜ້ອຍເກີນໄປຈະສົ່ງຜົນໃຫ້ມີການຂະຫຍາຍໜ້ອຍ ຫຼືບໍ່ມີການຂະຫຍາຍ.

ຢາຍັບຍັ້ງໃນຕົວຢ່າງ: ສານປົນເປື້ອນໃນຕົວຢ່າງສາມາດຍັບຍັ້ງປະຕິກິລິຍາ PCR. ພິຈາລະນາການຊໍາລະ DNA ຂອງທ່ານຫຼືໃຊ້ວິທີການສະກັດເອົາທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.

ການແກ້ໄຂ: ກວດເບິ່ງການອອກແບບ primer ຂອງທ່ານ, ເພີ່ມຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງແມ່ແບບ, ແລະໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າຕົວຢ່າງຂອງທ່ານບໍ່ມີສານຍັບຍັ້ງ.

2. ເປັນຫຍັງຜະລິດຕະພັນ PCR ຂອງຂ້ອຍຈຶ່ງມີຂະຫນາດທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ?

ຖ້າຂະຫນາດຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR ຂອງທ່ານບໍ່ເປັນໄປຕາມທີ່ຄາດໄວ້, ມັນອາດຈະຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງບັນຫາກັບເງື່ອນໄຂຂອງປະຕິກິລິຍາຫຼືສ່ວນປະກອບທີ່ໃຊ້.

ການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະ: ນີ້ສາມາດເກີດຂຶ້ນໄດ້ຖ້າ primer ຜູກມັດກັບເວັບໄຊທ໌ທີ່ບໍ່ໄດ້ຕັ້ງໃຈ. ກວດເບິ່ງຄວາມສະເພາະຂອງ primers ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງມືເຊັ່ນ BLAST.

ອຸນ​ຫະ​ພູມ Annealing ບໍ່​ຖືກ​ຕ້ອງ​: ຖ້າ​ຫາກ​ວ່າ​ອຸນ​ຫະ​ພູມ annealing ແມ່ນ​ຕ​່​ໍ​າ​ເກີນ​ໄປ​, ການ​ຜູກ​ມັດ​ທີ່​ບໍ່​ສະ​ເພາະ​ອາດ​ຈະ​ເປັນ​ຜົນ​. ການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງອຸນຫະພູມ annealing ໂດຍ gradient PCR.

ການແກ້ໄຂ: ຢືນຢັນຄວາມສະເພາະຂອງ primer ແລະເພີ່ມປະສິດທິພາບອຸນຫະພູມ annealing ເພື່ອປັບປຸງຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR.

3. ເຄື່ອງວິເຄາະ PCR ຂອງຂ້ອຍສະແດງຂໍ້ຄວາມຜິດພາດ. ຂ້ອຍຄວນເຮັດແນວໃດ?

ຂໍ້ຄວາມຜິດພາດໃນເຄື່ອງວິເຄາະ PCR ສາມາດເປັນຕາຕົກໃຈ, ແຕ່ພວກເຂົາມັກຈະສາມາດໃຫ້ຂໍ້ຄຶດຕໍ່ກັບບັນຫາທີ່ອາດຈະເກີດຂຶ້ນ.

ບັນຫາການປັບທຽບ: ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າເຄື່ອງວິເຄາະ PCR ຖືກປັບຢ່າງຖືກຕ້ອງ. ການບໍາລຸງຮັກສາເປັນປົກກະຕິແລະການກວດສອບການປັບທຽບແມ່ນສໍາຄັນຕໍ່ການໄດ້ຮັບຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຖືກຕ້ອງ.

ກຸ່ມຊອບແວ: ບາງຄັ້ງ, ຂໍ້ຜິດພາດຂອງຊອບແວສາມາດເຮັດໃຫ້ເກີດບັນຫາ. ປິດເປີດຄອມພິວເຕີຂອງທ່ານຄືນໃໝ່ ແລະກວດເບິ່ງການອັບເດດຊອບແວ.

ການແກ້ໄຂ: ເບິ່ງຄູ່ມືຜູ້ໃຊ້ສໍາລັບລະຫັດຂໍ້ຜິດພາດສະເພາະ ແລະປະຕິບັດຕາມຂັ້ນຕອນການແກ້ໄຂບັນຫາທີ່ແນະນໍາ. ການບໍາລຸງຮັກສາເປັນປົກກະຕິສາມາດປ້ອງກັນບັນຫາຫຼາຍຢ່າງ.

4. ເປັນຫຍັງຜົນປະຕິກິລິຍາ PCR ຂອງຂ້ອຍບໍ່ສອດຄ່ອງ?

ຜົນໄດ້ຮັບ PCR ທີ່ບໍ່ສອດຄ່ອງສາມາດເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມອຸກອັ່ງສໍາລັບເຫດຜົນຫຼາຍຢ່າງ:

ຄຸນນະພາບຂອງ Reagent: ຮັບປະກັນວ່າທາດ reagents ທັງໝົດ, ລວມທັງ enzymes, buffers, ແລະ dNTPs, ແມ່ນສົດ ແລະ ມີຄຸນນະພາບສູງ. ທາດປະສົມທີ່ໝົດອາຍຸ ຫຼື ປົນເປື້ອນອາດຈະເຮັດໃຫ້ເກີດການປ່ຽນແປງ.

Thermal Cycler Calibration: ການຕັ້ງຄ່າອຸນຫະພູມທີ່ບໍ່ສອດຄ່ອງອາດຈະສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ຂະບວນການ PCR. ກວດ​ສອບ​ການ​ປັບ​ທຽບ​ຂອງ​ເຄື່ອງ​ຈັກ​ລະບາຍ​ຄວາມ​ຮ້ອນ​ເປັນ​ປະຈຳ.

ການ​ແກ້​ໄຂ​: ການ​ນໍາ​ໃຊ້ reagents ຄຸນ​ນະ​ພາບ​ສູງ​ແລະ calibrate cycler ຄວາມ​ຮ້ອນ​ຂອງ​ທ່ານ​ເປັນ​ປົກ​ກະ​ຕິ​ເພື່ອ​ຮັບ​ປະ​ກັນ​ຜົນ​ໄດ້​ຮັບ​ທີ່​ສອດ​ຄ່ອງ​.

5. ວິທີການປັບປຸງປະສິດທິພາບຕິກິຣິຍາ PCR?

ການປັບປຸງປະສິດທິພາບຂອງປະຕິກິລິຍາ PCR ສາມາດນໍາໄປສູ່ຜົນຜະລິດທີ່ສູງຂຶ້ນແລະຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຫນ້າເຊື່ອຖືຫຼາຍຂຶ້ນ.

ປັບເງື່ອນໄຂການຕິກິຣິຍາໃຫ້ເໝາະສົມ: ທົດລອງໃຊ້ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ primers, ແມ່ແບບ DNA ແລະ MgCl2. ແຕ່ລະປະຕິກິລິຍາ PCR ອາດຈະຕ້ອງການເງື່ອນໄຂທີ່ເປັນເອກະລັກສໍາລັບການປະຕິບັດທີ່ດີທີ່ສຸດ.

ໃຊ້ enzymes ທີ່ມີຄວາມຊື່ສັດສູງ: ຖ້າຄວາມຖືກຕ້ອງແມ່ນສໍາຄັນ, ພິຈາລະນານໍາໃຊ້ DNA polymerase ທີ່ມີຄວາມຊື່ສັດສູງເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຜິດພາດໃນລະຫວ່າງການຂະຫຍາຍ.

ການແກ້ໄຂ: ດໍາເນີນການທົດລອງການເພີ່ມປະສິດທິພາບເພື່ອຊອກຫາເງື່ອນໄຂທີ່ດີທີ່ສຸດສໍາລັບການຕິດຕັ້ງ PCR ສະເພາະຂອງທ່ານ.

ສະຫຼຸບ

ການ​ແກ້​ໄຂ​ບັນ​ຫາ ກເຄື່ອງວິເຄາະ PCRສາມາດເປັນວຽກທີ່ໜ້າຢ້ານກົວ, ແຕ່ການເຂົ້າໃຈບັນຫາທົ່ວໄປ ແລະການແກ້ໄຂຂອງພວກມັນສາມາດເສີມຂະຫຍາຍປະສົບການ PCR ຂອງທ່ານໄດ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ໂດຍການແກ້ໄຂບັນຫາທົ່ວໄປເຫຼົ່ານີ້, ນັກຄົ້ນຄວ້າສາມາດປັບປຸງຜົນໄດ້ຮັບ PCR ແລະຮັບປະກັນຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຫນ້າເຊື່ອຖືໃນຄໍາຮ້ອງສະຫມັກຊີວະສາດໂມເລກຸນ. ການບໍາລຸງຮັກສາເປັນປົກກະຕິ, ການຄັດເລືອກລະມັດລະວັງຂອງ reagents, ແລະການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງເງື່ອນໄຂຕິກິຣິຍາແມ່ນກຸນແຈສໍາລັບການວິເຄາະ PCR ສົບຜົນສໍາເລັດ.